方法:通过建立逍遥散经口给药后大鼠血清色谱指纹图,确定大鼠血中移行成分的生药来源,并以血清色谱指纹图为指导,以血中移行成分来源生药为原料,定向富集制备逍遥散提取物;采用体外培养的小鼠B16黑素瘤细胞株,以熊果苷为阳性对照药,用MTT法、多巴氧化法、NaOH裂解法评价逍遥散提取物对细胞增殖、酪氨酸酶活性和黑素合成的影响,探讨逍遥散治疗黄褐斑的药效物质基础及作用机理。结果:购买激酶抑制剂分子库逍遥散经口给药后大鼠血中发现了14个入血成分,其中4个为血中原型成分,10个为原型入血或代谢产物,分别来自于柴胡、当归、白芍、甘草、茯苓。定向制备的逍遥散提取物对B16细胞酪氨酸酶活性和黑素合成有明显的抑制作用,作用强度呈浓度依赖性。结论:逍遥散的血中移行成分具有抑制B16细胞酪氨酸酶活性和黑素合成的作用,是逍遥散治疗黄褐斑的药效物质基础。”
ALK assay
“目的用酵母双杂交技术筛选白细胞中乙型肝炎病毒(HBV)前S1蛋白反式激活蛋白3(PS1TP3)的结合蛋白。方法通过聚合酶链反应扩增获得的PS1TP3基因,构建诱饵质粒pGBKT7-PS1TP3,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库的质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在涂有X-α-Gal营养缺陷型培养基(MetforminSD/-Trp-Leu-His-Ade)上进行双重筛选,提取阳性酵母克隆的质粒转化大肠杆菌经BglII酶切后测序,进行生物信息学分析。结果筛选出30个与PS1TP3相互作用的蛋白,其中包括泛素蛋白酶E2、丝裂原活化蛋白激酶、β2-微球蛋白、磷酸酯酶张力蛋白等已知功能基因及4个未知功能序列,以及拼接新基因1个。结论成功克隆出PS1TP3蛋白的结合蛋白,为研究PS1TP3的分子生物学功能及HBV的致病机制提供了新的思路和线索。